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エンボス
エンボスとは、クレジットカード、キャッシュカードなど、カード表面にある凸面の刻印をする特殊印刷のことをいいます。
予備校では配列を決定したいDNA断片の端を標識する以外には方法がないが、サンガー法ではデオキシリボヌクレオチドを標識しておく元々の方法以外にも、プライマーまたはターミネーターを標識しておく方法の計3通りが考えられる。放射性標識の場合、最初は検出感度が良くなるデオキシリボヌクレオチドの標識が使われたが、サイクルシーケンス法により感度が上がるとシグナルが均一になるプライマーの標識が使われるようになった。一方、蛍光標識の場合にはデオキシリボヌクレオチドの標識は合成反応に影響を与える可能性があり好ましくない。
プライマーを蛍光標識する方法をダイプライマー法 (dye-primer) と呼ぶ。この方法ではプライマーの標識とターミネーターの種類を対応させる必要があることから、反応は4つに分けて行い、それを混ぜて泳動することになる。標識プライマーを常に4種類用意する必要があるため、通常は特定のベクターにクローニングして、そのベクター配列を認識する標識済みプライマーを使い回すことになる。
塗装工事、ターミネーターを蛍光標識する方法をダイターミネーター法(dye-terminator)と呼び、こちらが現在の主流となっている。この方法では4種類のターミネーターがそれぞれ異なる蛍光色素で標識されているため、1つの系に4種類のターミネーターを加えて反応を行い、それをそのまま泳動するだけで済む。プライマーを標識する必要がないため、サブクローニングせずに新しくプライマーを設計して続きの配列を読むこと（プライマーウォーキング法）もより安価にできる。逆にダイターミネーター法の欠点としてシグナル強度が不揃いになりやすく、ダイプライマー法と比べて一度に読める配列が短くなる傾向が挙げられる。ダイターミネーターには大きな蛍光発色団がついているため、通常のジデオキシヌクレオチドと比べてDNAへの取り込み効率が鋳型配列によって変化しやすいためである。かつてはダイターミネーターはダイプライマーの半分程度の長さしか読めないとされていた。しかしこれはDNAポリメラーゼと標識色素の改良によって大きく改善され、現在では1,000塩基程度とダイプライマー法と比べても遜色のない性能になっている。
DNAを構成するヌクレオチドの結合順序（塩基配列）を決定することである。DNAは生物の遺伝情報のほとんど全てを担う分子であり、基本的には塩基配列の形で符号化されているため、DNAシークエンシングは遺伝情報を解析するための基本手段となっている。手法としては1977年に開発されたサンガー法が改良を加えながら用いられているが、最近新しい方法も開発されており中には実用化されているものもある。
おせちには生命体に必要な情報が符号化されているので、配列決定はミクロなレベルの生物学の基盤となっているし、分類学や生態学のようなマクロな生物学でも盛んに応用されている。また医学面でも遺伝病や感染症の診断や治療法の開発などに役立っている。ウォルター・ギルバートとフレデリック・サンガーは、DNAシークエンシングの手法を開発した功績により1980年のノーベル化学賞を受賞している。
これはDNA複製酵素であるDNAポリメラーゼを用いて末端が特定の塩基に対応するDNA断片を合成する方法である。まずプライマーとして配列を読みたい1本鎖DNAの特定の位置に相補的なオリゴヌクレオチドを使うことで、DNA合成の開始点を1ヶ所に決める。そこからDNA合成を始めて、それぞれの塩基に対応する位置で合成が止まる様な反応系を使うことで、塩基特異的なDNA断片が得られる。もともとフレデリック・サンガーが中心になって開発したためサンガー法と呼ばれているが、長年にわたって改良が続けられているため必ずしも明確な表現ではない。ここでは改良されていく一連の方法の総称として用いることにする。
サンガーはまず1975年にプラスマイナス法 [1] と呼ばれるやや複雑な方法を発表した。これは短時間の単なるDNA合成をした後で、4種類のデオキシリボヌクレオチド（dATP・dGTP・dCTP・dTTP）のうち1種類だけを欠く反応系で合成を再開し（マイナス法）、その結果から配列を解読する方法である。最初に普通のDNA合成をしているので、この段階では合成したDNAの長さはランダムになっている。そこからたとえばdATPのみを欠く系で合成を再開すると、必ずアデニンを組み込むべき位置で反応が止まる。したがって得られたDNA断片は様々な長さのものがあるがランダムではなく、アデニンに対応した断片が得られる。同様に、dGTPのみ、dCTPのみ、dTTPのみを欠く系を用いることで、塩基特異的なDNA断片を得ることができる。原理的にはこれだけで配列が読めるはずだが、実際にはうまく読めない部位がでてしまうため、1種類のデオキシリボヌクレオチドだけを加えた系（プラス法）を4つ追加して、全部で8つの反応系の組み合わせで配列を読む煩雑な方法であった。
反応系にヌクレオチド（dATP・dGTP・dCTP・dTTPのいずれか1種類）を加える。
ヌクレオチドがDNAに取り込まれるとピロリン酸が生じる
ピロリン酸が、ATPスルフリラーゼによってアデノシン5'-ホスホ硫酸に付加されてATPが生じる
ATPとルシフェラーゼによりルシフェリンが発光する
発光量を測定する
余剰のヌクレオチドを除去する
以上をヌクレオチドの種類を変えながら繰り返す。例えば右表のような発光パターンであれば、そのDNA配列はATGGCTということになる。
最後の余剰ヌクレオチドの除去には、大きく分けて2通りの方法がある。一つは固相法で、鋳型のDNAを何らかの固相の基質に結合させておき、反応液を洗い流して除去する方法である。もう一つは液相法で、アピラーゼを加えてヌクレオチドを分解する方法である。
現状では1度に数十塩基から100塩基程度しか決定できないが、比較的低コストで配列を決定できるために一塩基多型 (SNP) 解析などで使われている。特に2005年にこの原理を応用した大規模シークエンサーが発売され、サンガー法の10分の1のコストで大量の配列決定ができるとして注目を集めている。
1990年代から、逆にDNA分子を端から1塩基ずつ分解していき、その過程を監視する方法が考えられている。4種類のデオキシリボヌクレオチドをそれぞれ蛍光色素で標識しておき、さらにビオチン化プライマーを用いてDNAポリメラーゼで相補鎖を合成させる。その後何らかの固相の基質に合成した相補鎖を固定しておき、水流のなかで3'-5'エキソヌクレアーゼにより相補鎖を分解させる。すると水流中に順番に蛍光標識されたヌクレオチドが流れてくるので、これを検出することで配列を決定するという方法である。この方法は毎秒100〜1,000塩基という非常に高速な配列決定が可能だと考えられるが、実用化にはまだまだ遠い状況である。
修飾を受けた塩基が含まれている場合には効果が高い。
DNAポリメラーゼによる伸長反応を監視して配列を決定する方法が何種類か開発されている。実はサンガー法あるいはマクサム−ギルバート法の開発以前は、DNA合成によって放射性標識したデオキシリボヌクレオチドが取り込まれるかどうかをチェックすることで配列を決定していたので、より古い方法だといえる。
1980年代から開発が始まり、1990年代後半になってMostafa Ronaghiらが実用化した方法で、ヌクレオチドがDNAに取り込まれるときに放出されるピロリン酸をATPに変化させて発光反応に用いることで、ヌクレオチドがどれくらいDNAに取り込まれたかを定量できるという原理に基づいている。実際にはデオキシリボヌクレオチドを1種類ずつ加えて発光量を測定しては除去することを繰り返すことで、配列を決定する。
反応系には鋳型となる一本鎖DNAとプライマー、DNAポリメラーゼの他に、ATPスルフリラーゼ、ルシフェラーゼ、アデノシン5'-ホスホ硫酸 (APS)、ルシフェリンなどが必要である。