ネットキャッシングを知ろう!
- ■Infomation
-
オーソリゼーション
オーソリゼーションとは、クレジットカードの使用が可能かどうか、クレジットカード発行会社に信用承認(販売してよいかどうかの是非)を求めることをいいます。
テレマーケティングあるいは分子が電場(電界)中を移動する現象。あるいは、その現象を利用した解析手法。特に分子生物学や生化学ではDNAやタンパク質を分離する手法としてなくてはならないものである。
19世紀初めにロシアの物理学者Reussが水中の粘土粒子で発見したのに始まる。19世紀終わりからタンパク質やアミノ酸などの研究に用いられ、1930年代にティセリウスによってタンパク質の移動度を調べる方法として確立された。これは水溶液を用いる「無担体電気泳動」であったが、第2次大戦後、濾紙やデンプンゲルなどの担体を用いた電気泳動が発展した。濾紙電気泳動(現在は主としてセルロースアセテート膜を使う)は臨床検査で血清タンパク質を分析する方法として用いられている。一方ゲルとしては、その後 アガロース がよく用いられるようになり、現在でもDNA断片の分離・分析に用いられる。また1960年代に ポリアクリルアミドゲルが開発され、これはタンパク質の分析やDNAの塩基配列決定に用いられる。ポリアクリルアミドゲルを用いたタンパク質分析法の一種として等電点電気泳動や二次元電気泳動がある。最近では無担体電気泳動であるキャピラリー電気泳動が自動塩基配列決定に用いられている。
家庭教師は、アガロース(寒天の主成分)ゲルを使用した電気泳動により、核酸をその大きさに応じて分離する手法。数ある電気泳動の中でも、もっともオーソドックスなものといえる。
パルスフィールドゲル電気泳動(-でんきえいどう、pulsed-field gel electrophoresis、PFGE)とは、分子量の特に大きいDNA断片を分離するためのゲル電気泳動の1方法である。基本的なアイデアは1982年(公開は1984年)にコロンビア大学(当時)のCharles R. CantorとDavid C. Schwartzによって発明された[1]。
10キロ塩基対(キロは1000を示す)程度以下の断片はアガロースゲル電気泳動などで分子量による分離をすることができるが、数十キロ塩基対を超える場合には分子ふるい効果が働かずうまく分離しない。PFGEであれば数万キロ塩基対までの巨大なDNA分子を分離することができる。
看護師 求人などの核酸分子はそれぞれ固有の大きさ(長さ)と荷電を持っている。核酸の場合は荷電の個数は分子の大きさに比例するため、泳動距離は分子量の大きいものほど流れにくく、小さいものほど流れやすい。アガロースゲルに細かな目があると想像するとよい。
適切な緩衝液に高純度のアガロースを加え、加熱して溶かした後、型枠に入れて固める。アガロースの量は、目的に応じて0.8-4%と様々である。このときあらかじめ、櫛(くし)状のプラスチック片を利用して核酸溶液を注入するための穴(wellと呼ばれる)を一方の端に作る。
固まったゲル片を緩衝液の入った水槽に入れ、核酸溶液を注入した後、一方から電圧をかける。一定時間後、ゲル片を取り出し、臭化エチジウムなどの核酸染色溶液に浸漬する。染色薬剤をあらかじめ元の核酸溶液やアガロースゲルに添加しておく場合もある。染色された核酸は紫外線を照射すると蛍光を発するので、その存在が確認できる。また染色に使われた臭化エチジウムの量はDNAの分子の長さと量に比例するため、蛍光の強さによってDNA量を確認することができる。
DNA鎖がゲル中を移動するには電場の方向に長く延びる必要がある。電場の方向が変わると、分子量の小さいものほどこの配置変化が速く起きるため、結果的に速く移動できると考えられている。
デザイン会社させかたによって、大まかに2通りに分けることができる。なお、初期にはOFAGE(orthogonal-field agarose gel electrophoresis)という電極が直交し電場が均一でない装置が使われていたため、泳動結果が非常に見づらかった。現在では均一な平行電場を用いるため、通常のアガロースゲル電気泳動と同様な泳動結果が得られる。
もっとも単純な方法がFIGE(Field Inversion Gel Electrophoresis)である[2]。これは電場をかける向きを定期的に反転させ続けるだけのものである。移動速度は同じでも、分子量の小さいDNA断片ほど迅速に反転できるため、次第に分子量に応じて分離されることになる。この方法は簡便だが、600キロ塩基対程度までしか分離できない。改変法として、反転させるだけでなく電場の強さも変化させるZIFE(zero integrated field electrophoresis)がある。これらは通常のアガロースゲル電気泳動の装置の電源部に比較的単純な改造を加えるだけで実現できる。
現在一般的なのは、電場を2方向に交替させることでDNA断片をジグザグ進行させ、2つの方向の中間方向に向けて分離させる方法である。まずある1つの方向に電場をかける。一定時間後に電場の方向を、最初の電場の方向と交差する方向に切り替える。さらに一定時間後にもとの方向に電場をかける。この電場の切り替えを繰り返すと、DNAはジグザグ進行しながら2つの電場方向の中間の方向に移動し、分子量の小さいものほど移動度が大きくなる。電場を交替させる仕掛けによってCHEF(contour-clamped homogeneous electric field)、TAFE(transverse alternating field electrophoresis)、RGE(rotating gel electrophoresis)など様々あるが基本的な考え方は同じである。いずれも専用の装置を必要とするが、事実上CHEFが市場を席巻している。
PFGEによって巨大なDNA分子の分析が可能になったが、巨大なDNA分子は物理的に分断されやすく、より慎重な取り扱いが求められる。通常用いられている抽出法ではDNA分子がランダムに分断されてしまいPFGEには適さない。物理的な分断を防ぐために、低融点アガロースに細胞を包埋したプラグ(plug)を作製し、そのままの状態でタンパク質分解や、必要に応じて制限酵素処理などを行ってPFGEに用いるのが一般的である。
2000キロ塩基対程度までのDNA分子は4〜6 V/cm程度の電場をかけることができる。それ以上の分子はDNAがゲルに絡まって泳動されなくなってしまうため、もっと弱い電場で時間をかけて分離する必要がある。
交替間隔
電場を交替させる間隔は長くするほど、より高分子のDNAの分離が良くなる。
角度
(CHEFやRGEの場合)2つの電場の方向が成す角度は120度が標準的であるが、角度を小さくするとより速く泳動が進む。96度から165度まで変化させても分離能にはほとんど影響がない。
緩衝液
TAE緩衝液とTBE緩衝液の両方が使われる。温度上昇を防ぎ泳動速度を上げるために、0.5倍または0.25倍濃度の緩衝液を利用するのが普通である。
アガロースゲル
アガロースは電気浸透度が低いもののほうが泳動速度が上がるため望ましい。ゲル濃度は濃い方が分解能が上がるが、その分泳動速度は下がる。
温度
DNA分子の泳動速度は温度によって変わるため、泳動中を通じて一定温度に保つことが重要である。温度を上げれば泳動速度が上がるが、そのぶん分解能が犠牲になる。
特殊な方法として、電場の向きによって電界強度を変えることで、直鎖状DNAと環状DNAを弁別することができる。
出芽酵母の人工染色体(YAC)などを使う長いDNA断片のクローニング
細菌性食中毒から検出された原因菌の疫学的解析
生物から核酸(DNAやRNA)を抽出した際、その確認のためにアガロースゲル電気泳動を行う。また、PCRによりDNAを増幅したときにも、確認に使用される。その後、サザンブロッティングやノーザンブロッティング、ゲル抽出などを行うこともある。 プラスミドベクターに組み込んだ目的の遺伝子を確認するため、制限酵素処理を行った後、電気泳動で確認することもある。
荷電粒子や分子はその荷電と反対の極に向かって移動する。移動中にpH 勾配があると、荷電が0となる点(等電点)で停止する。これが等電点電気泳動であり、タンパク質の分析に用いられる。