ネットキャッシングを知ろう！
- ■Infomation
-
オートローン
オートローンとは、自動車購入を目的とした消費者ローンのことや、自動車を主体とする割賦販売システムのことをいいます。
外国為替証拠金取引がこれを改良して1977年に発表した方法 [2] が、ジデオキシ法、ないし鎖停止法と呼ばれ広く知られているものである。これは4つの通常のDNA合成系を用意し、そこに低濃度の鎖停止ヌクレオチド（ターミネーター）を加えて反応させるようにしたものである。ターミネーターは4種のジデオキシヌクレオチド (ddATP・ddGTP・ddCTP・ddTTP) のうちそれぞれ1種類だけを用いる。DNAポリメラーゼは鋳型配列に対応するデオキシリボヌクレオチドを取り込みながらDNAを合成していくが、ときどき対応するターミネーターを取り込んで反応がそこで止まってしまうことが起きる。結果的に使ったターミネーターの塩基に対応する様々な長さのDNA断片が生じることになる。例えばターミネーターとしてddATPを加えた系では、生じたDNA断片の3'末端の塩基はアデニンになるという具合である。これならば最初に単なるDNA合成をする必要がないし、4つの反応系だけできちんと配列が確定できる。
資産運用は後にポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) が開発されたことでさらに効率化された。PCRでは2本鎖DNAを高温で変性させてから温度を下げてプライマーを結合させてDNAを合成し、そのあと再び高温で変性させて鋳型DNAを再利用することができる。この発想をサンガー法と組み合わせることで、比較的少ない量の二本鎖DNAから反応を始めることができるようになった。この方法を特にサイクルシークエンス法と呼ぶ。
元々はデオキシリボヌクレオチドを放射性標識しておき、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により断片長に応じて分離して、オートラジオグラフィーにより検出していたが、その後、蛍光標識やキャピラリー電気泳動といった技術を取り込むことで飛躍的に発展した（後述）。
サンガー法は酵素反応に依存しているため、PCRと似たような問題点が出ることがある。プライマーによって反応の開始点を決めるので、プライマーの特異性が低いと複数の配列を同時に読むことになり配列を決定できない。これはプライマーを結合させる温度が高くなるように設計することで改善できることがある。また反応系にRNAが混じっているとそれがプライマーとして働いて配列が読めなくなることがある。GC比が高かったり反復配列や二次構造を取りやすい配列があると、そこでDNAポリメラーゼの反応が止まりそれ以降の配列が得られないことがある。これに関しては複製系ではなく翻訳系（RNAポリメラーゼ）を用いた同様のシステムで解決することがある。
アラン・マクサムとウォルター・ギルバートが1977年に報告した [3] 手法で、マクサム−ギルバート法ないしギルバート法と呼ばれる。DNA断片中の特定の塩基を試薬により修飾することで、その部位のリン酸ジエステル結合が切れやすくなることを利用している。試薬の作用条件を調節することでDNA断片1分子あたり平均1ヶ所だけが修飾されるようにすると、特定の塩基で切断された様々な長さのDNA断片を得ることができる。配列を決定したいDNA断片の端を32Pやビオチン、蛍光色素などで標識しておき、フィルムを感光させたり酵素的に色素生成させて検出する方法が一般的である。
元々は以下のような試薬を利用した組み合わせで判別していた。ほかにも様々な塩基特異的な切断反応が考案されている。
プリン塩基（グアニン・アデニン)をメチル化する。ここでメチル化されたプリン塩基のグリコシド結合は不安定で塩基が遊離しやすく、その後アルカリ条件で加熱することでリン酸ジエステル結合が切断される。グアニンはアデニンと比べて5倍速くメチル化される一方、グリコシド結合はグアニンよりアデニンの方が不安定である。そこで塩基を遊離させるときに、強い条件（高温中性）にするとグアニン塩基で切断されやすく、弱い条件（低温酸性）にするとアデニン塩基で切断されやすい。この2つの反応産物を見比べることでグアニンとアデニンを判別する。
ヒドラジン
ピリミジン塩基（シトシン・チミン）を開裂させる。そのままだと両塩基で切断されるが、高濃度の塩化ナトリウムが存在するとチミンの開裂が阻害されてシトシン塩基だけで切断される。この2つの反応産物を見比べることでシトシンとチミンを判別する。
水酸化ナトリウム
アデニン塩基とシトシン塩基を開裂させる。ジメチル硫酸の弱い条件の代わりに用いる。
この方法は充分な量のDNAと、ヒドラジンなど取り扱いに注意を要する試薬が必要という欠点がある。したがってサンガー法が改善されるとともに、次第に一般的なシークエンスの手法としては用いられなくなった。しかし酵素反応を介さずに直接DNA分子の解析ができることから、修飾塩基を含むような配列決定や、タンパク質との相互作用を検出する目的で使われている。
投資信託によるオートラジオグラフィーの一部DNA断片の長さを知るためには普通は電気泳動法を用いて分離する。元来はスラブ（平板）型のポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離するのが主流であった。しかし自動化・高速化の流れの中で1990年にキャピラリー電気泳動による装置が登場し、21世紀を迎えると主流はキャピラリー電気泳動に移った。キャピラリー電気泳動の利点は、径が小さい（0.1mm以下）ことから発熱の制御が容易で、その分高電圧で電気泳動することが可能なため高速・高分解能になることである。最近ではさらに微細・高速化を図るマイクロチップ電気泳動による装置が登場している。
以前は放射性標識が一般的に用いられており、泳動したスラブゲルを乾燥させX線フィルムを感光させて塩基配列を読み取っていたが、放射性標識は取り扱いに制約があることから忌避される傾向がある。あまり一般的ではないがビオチン標識を介した化学発光系を使う方法もある。しかし現在一般的に利用されているのは、蛍光標識を用い自動化されたDNAシークエンサーである。蛍光標識の決定的な利点は、4種類の塩基に対応したそれぞれ波長が異なる蛍光色素で標識することができ、そのため1つの配列を読むのに1つの検出系だけで足りるということである。またX線フィルムの代わりに撮像素子を使うことでより迅速・簡便に利用できる。
マクサム−ギルバート法では配列を決定したいDNA断片の端を標識する以外には方法がないが、サンガー法ではデオキシリボヌクレオチドを標識しておく元々の方法以外にも、プライマーまたはターミネーターを標識しておく方法の計3通りが考えられる。放射性標識の場合、最初は検出感度が良くなるデオキシリボヌクレオチドの標識が使われたが、サイクルシーケンス法により感度が上がるとシグナルが均一になるプライマーの標識が使われるようになった。一方、蛍光標識の場合にはデオキシリボヌクレオチドの標識は合成反応に影響を与える可能性があり好ましくない。
プライマーを蛍光標識する方法をダイプライマー法 (dye-primer) と呼ぶ。この方法ではプライマーの標識とターミネーターの種類を対応させる必要があることから、反応は4つに分けて行い、それを混ぜて泳動することになる。標識プライマーを常に4種類用意する必要があるため、通常は特定のベクターにクローニングして、そのベクター配列を認識する標識済みプライマーを使い回すことになる。